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多肽合成简介

定义:

多肽是α-氨基酸 以肽链连接在一起而形成的 化合物。

分类:由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二 肽,同理类推还有三肽、四肽、五肽等。通常由10~100氨 基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽。它们的分子量低 于10,000Da(Dalton道尔顿)。由2~10个氨基酸组成的 肽称为寡肽(小分子肽);10~50个氨基酸组成的肽称为 多肽;由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质。

1902年

1902年

德国化学家费雪

首先合成二肽,获得诺1902贝尔化学奖。

1906年

1906年

德国化学家费雪

首次合成了18肽

1932年

1932年

马克斯·伯格曼

在氨基酸保护基和缩合试剂方面有了些突破,极大的推动了多肽化学研究。

1953年

1953年

美国人杜·维尼奥

首次合成多肽激素--催产素Oxytocin,获得诺1955贝尔化学奖。

1955年

1955年

英国人桑格

首次测定了胰岛素的全部氨基酸序列,获得了1958年诺贝尔化学奖。

1963年

1963年

美国人梅里菲尔德

提出了固相多肽合成方法(SPPS),这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法, 获得了1984年诺贝尔化学奖。

1965年

1965年

中国科学家

首次合成了牛胰岛素。

1972年

1972年

卡皮诺

首先将9-芴甲氧羰基(FMOC)用于保护氨基,HATU为缩合试剂。

Polypeptide application
多肽应用
多肽的合成方法有:

1、生物合成方法

2、酶催化合成法

3、化学合成方法(包含液相合成和固相合成)

多肽固相合成
定义:
从C端(羧基端)向N端(氨基端)重复添加氨基酸的过程。
设计方法:
先将所要合成肽链的羟末端氨基酸(C端)的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连,然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去 氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应,接长肽链。重复(缩合→洗涤→去保护→洗涤→下一轮缩合)操作,达到所要合成的肽链长度,最后将肽链从树脂上裂解下来,经过纯化等处理,即得所要的多肽。
分类:
其中α-氨基用BOC(叔丁氧羰基)保护的称为BOC固相合成法,α-氨基用FMOC(9-芴甲氧羰基)保护的称为FMOC固相合成法,

树脂选择
固相合成中所使用的树脂:
1、一般都是聚苯乙烯-二乙烯苯,聚乙二醇包被聚苯乙烯(PEG-PS),聚丙烯酰胺三种材料,大小在75-150μm, 交联度在1-2%之间,现在使用的大多是1%。因为这种交联 度下,树脂在DMF,DCM中具有很好的溶胀性能,立体上是一个空间网状结构,反应物分子可以在树脂内部自由移动 。
2、树脂最关键的部分是连接手臂,它一端连接在树脂上,一端作为反应位点。
3、目前广泛使用的树脂有:wang,2-氯三苯基氯树脂,Rink Amide AM Resin,Rink Amide MBHA Resin等。
常用催化试剂
Common catalytic reagents

 
茚三酮检测:

固相多肽合成中,主要是通过检测树脂上游离氨基来判断连接效率,检测方法称为Kaiser方法,其检测结果,如果有游离氨基的时候,显示兰色,或红褐色(pro,ser,His)。

Kaiser试剂包括:

A,5%茚三酮的乙醇溶液

B,80%苯酚的乙醇溶液

C,2%0.001M KCN的吡啶溶液

配制中的吡啶需要经过茚三酮处理后,重蒸后再使用。检测过程,取少量树脂,加入A,B,C各2-3滴,105-110℃下加热5min,如果溶液有兰色,或树脂出现兰色,红褐色,表明还有游离氨基,否则说明连接完全。

SPPS过程简介
SPPs process introduction

过程简介
【·】对于生成肽酰胺的树脂,如Rink-Amide-AM,MBHA树脂。其连接条件同多肽偶合条件,一般采用HBTU/HOBt/DIEA,DIC/HOBt等。
【·】对于羟甲基树脂,如Wang,PAM,HMBA,采用DCC/DMAP方法连接,未反应的羟基,用醋酸酐/吡啶/DMAP封闭。
【·】对于2-Cl-Trt树脂,反应条件非常简单,只须在氨基酸溶 液中加入2-3当量的DIEA,而且该反应速度快,一般30min 就完成反应,反应后用MeOH/DIEA封闭。需要注意的是该树脂对酸特别敏感。
缩合反应
副反应
氨基酸消旋
氨基酸消旋与氨基酸种类以及反应条件有关系,比较容易发生消旋的氨基酸有Phe,Cys,His。但是如果采用合适的缩合试剂以及反应条件,可以将氨基 酸消旋控制在很低的水平。
氧化
氧化反应主要发生在序列中Met,Cys,Trp,Tyr等几个氨基酸。但是由于Cys,Trp,Tyr在合成中侧链都是保护的,只有Met一般是不保护的,因此,对于含有Met的多肽序列,要避免长时间在空气流中。Met氧化成为Met(O) 后,可以通过在切割过程中加入Me2S,将其还原。二酮哌嗪(DKP)反应
DKP反应
发生在Wang树脂,而且C端氨基酸为Pro的时候,当第二个氨基酸脱Fmoc的条件下,发生该副反应,反应极其迅速。当第一个氨基酸为Gly,Ser的时候,也可能发生。
固相合成多肽裂解
裂解及侧链保护基脱除:
Fmoc法裂解和脱侧链保 护基时可采用强酸.TFA为应用最广泛的强酸试剂。